在线净化与固相萃取的比较-简单/方便

http://www.thermo.com.cn/Resources/201104/29123547853.pdf

在线净化LC-MS/MS
系统对动物组织中克伦特罗残留的检测分析
赵孔祥1 王海鉴2
1. 天津出入境检验检疫局食检中心；2. 赛默飞世尔科技（ 中国） 有限公司
克伦特罗俗称瘦肉精，常被用作饲料添加剂以提高家
畜的瘦肉含量，但由于其严重的毒副作用，欧盟于1988
年1 月1 日起禁止盐酸克伦特罗物质当饲料添加剂使用。
1991 年被FDA 禁止。1997 年，中华人民共和国农业部下
文严禁β- 肾上腺素类激素在饲料和畜牧生产中使用，盐酸
克伦特罗列为*位。2009 年7 月为应对日、韩从我国食
品中检出盐酸克伦特罗事件，质检系统确定了了更严格的
出口判定标准（0.05μg/kg），食品检测已经进入超痕量时代。
在此背景下，我们需要更有效的前处理手段以便我们
得到更加浓缩更加纯净的样品来提高我们的信号降低我
们的噪音。基于色谱原理的创新样品制备方法——Turbo
Flow 技术为我们提供了新的思路。这种在线自动过程处理
技术结合了扩散、化学和体积排除的原理，在捕获感兴趣
分析物的同时，快速消除基质干扰。本实验旨在建立一个
前处理简单，选择性灵敏度高的克伦特罗的Turbo Flow 实
用在线净化方法，并确定该方法的检出限。
1 实验部分
1.1 样品制备
取5g 动物组织样品与10mL 乙腈，10% 乙酸铵（1:3）
混合溶液混匀匀浆10 分钟，5000r/min 离心十分钟取
1mL 上清液经过0.22μm 注射过膜，上机。
1.2 Turbo Flow 条件
系统：
Thermo Scientific Aria
TLX-1 controlled by Aria. software
在线净化柱： Turbo Flow Cyclone MCX 0.5×50mm
进样体积： 50μL
上样溶剂： 0.1% 的甲酸水溶剂
上样流速： 2mL/min
洗脱溶剂： 1%的氨水甲醇溶液
洗脱体积： 50μL
1.3 HPLC 方法条件
色谱柱：Hypersil GOLD aQ 3μm 100 X 2.1mm
流路A ：0.1% 的甲酸水溶液
流路B ：甲醇
时间（min） A% B% 流速mL/min
0 90 10 0.4
1 90 10 0.4
2.33 80 20 0.4
2.83 60 40 0.4
6 10 90 0.4
6.5 10 90 0.4
8 90 10 0.4
1.4 质谱条件
1.4.1 调谐参数
系统 TSQ Ultra AM
离子源极性： 正离子模式
喷雾电压： 4500V
鞘气压（N2）： 50arb
辅助气压（N2）： 16arb
毛细管柱温度： 350°C
碰撞气体（Ar）： 1.5mTorr
Skimmer offset 10V
Q1/Q3峰分辨度： 0.7u （单位质量）
1.4.2 SRM 反应参数
被分析组分
母离子
（m/z）
子离子
（m/z）
碰撞能量
（V）
管透镜电压
（V）
克伦特罗-D9 286 169.1 28 104
克伦特罗277 132.2 29 94
168.1* 28 94
203.6 15 94
* 为定量离子
2 结果与讨论
食物样品本身基质比较复杂，在进行检测之前往往
需要一个较长的样品预处理过程。比如贾晓飞等使用酶
解，高氯酸沉淀蛋白，邵兵等应用HLB 和MCX 两次SPE
对食品中β2- 受体激动剂进行残留检测都取得了很好的效
果，这些方法的目的也都是为了获得更加浓缩和纯净的样
品。应用Turbo-Flow 在线净化技术使得这些工作变得更加
图1 Turbo Flow 在线净化与HPLC 联用方法参数
热点聚焦 Hotspot
简洁方便，减少了中间步骤和偶然误差，使得加标回收的
重复性很稳定，0.05μg/kg 浓度下六平行RSD 为5.36% ；
同时由于样品更加纯净浓缩，干扰较少，此方法在添加量
为0.02μg/kg 浓度下峰型良好（ 如图2 所示）。根据欧盟
法规计算此方法检出限（LOD） 为0.002μg/kg，定量限为
0.006μg/kg 已经能轻松应对实际需要。同时如果有实际
需要，可以采用更长的净化柱（100mm 规格） 或者采用串
联净化柱的方法进一步增加样品浓缩倍数，来提高检出限。
由于采用了在线净化系统，进入分析色谱柱的样品也更
图2 0.02μg/kg 浓度色谱图
图3 20pg/g 添加回收比较图。左图为MCX 固相萃取净化，右图为在线净化结果
为纯净，一定程度上降低了噪音和杂峰的产生。如图3 所示，
采用Turbo Flow 技术一定程度上起到了稳定基线的作用。
运用Transcend 在线净化系统的操作软件Aria OS 的
变量设置功能，可以方便设置批处理程序尝试不同的洗
脱溶液。在比较不同浓度的氨水甲醇溶液后，结果表明
1% 的氨水甲醇溶液作为洗脱溶液的效果*。使用外
标法计算其与不经过净化柱的结果得到其回收率为
79%~84%。而且此浓度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min 的
速度与0.4mL/min 的分析柱溶液混合不会对液相色谱
产生不良影响，在使用此方法千针后，10 个平行的保留
时间RSD 仍然只有0.1%。
分别配置5pg/mL，10pg/mL，20pg/mL，50pg/mL，
100pg/mL，200pg/mL，500pg/mL，1ng/mL，2ng/mL
的克伦特罗标准溶液，其中都混有100pg/mL 内标，内标
法定量得到标准曲线有很好的线性（ 曲线见图3），相关系
数R2 为0.9995
向5g 动物组织中分别添加100pg、250pg、500pg
克伦特罗标准，内标法定量，计算其回收率结果表明，经
过在线净化和内标法校正后样品回收率非常稳定。简单的
前处理步骤带来zui少的偶然误差。
表1 克伦特罗不同添加水平回收率
添加水平平均回收率% RSD%*
20pg/g 94.2 5.58
50pg/g 96.5 5.36
100pg/g 94.4 2.49
* 为六平行水平下RSD 值
3 结论
采用Turbo Flow 在线净化技术可以非常方便的按要求
得到更加浓缩，干扰更少的样品，提高了信噪比，降低了
检出限。
Turbo Flow 图4 克伦特罗标准曲线在线净化技术简化了前处理步骤，减少了
热点聚焦 Hotspot
偶然误差获得了令人满意的重现性。
使用Aria OS 操作系统，我们可以很方便的设置批处
理变量，尝试不同种类或者比例的上样或者洗脱溶剂。
4 参考文献
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